摘要目的: 观察步长脑心通对血管性痴呆大鼠认知功能及脑组织血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量的影响, 并与甲磺酸双氢麦角毒碱作用效果进行比较。

方法: 实验于 2005- 07 /11 在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所七室完成。①选用清洁级 15～18 月龄 Wistar 大鼠 48 只, 雌雄不拘,体质量( 200±20) g。按随机摸球法将 48 只大鼠分为 4 组: 假手术组、模型组、中药组和西药组(阳性对照组), 每组 12 只。除假手术组外( 进行假手术) , 其余组大鼠均采用改良 Pulsinellis 四血管阻断法建立血管性痴呆模型。中药组:以 0.45 g/( kg·d) 剂量灌胃步长脑心通混悬液, 由咸阳步长制药有限公司生产,由黄芪、乳香、没药、全蝎、地龙等 16 味中药组成, 0.4 g/粒; 西药组: 以 0.32 mg/( kg·d) 剂量灌胃甲磺酸双氢麦角毒碱混悬液, 该药由瑞士山德士药厂与天津华津制药厂合作生产, 生产批号: 970141, 1 mg/片; 假手术组和模型组灌胃同容量生理盐水; 每天分早、中、晚 3 次。术后当天开始用药, 连续 8周。②于造模前, 造模后 2,4, 8 周进行穿梭箱检查, 以主动回避反应比率表示大鼠的认知能力。于给药结束后采用放射免疫分析法测定大鼠大脑皮质、下丘脑、海马血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量。③对数据进行单因素方差、均数间多重比较 q 检验; 数据间相关性处理采用直线相关分析。

结果: 造模过程中如有动物死亡则补充相应只数, 最终进入结果分析的大鼠保持为 48 只。①主动回避反应比率: 模型组和中、西药组大鼠术后2, 4, 8 周明显低于假手术组(P < 0.01); 2 个治疗组均明显高于模型组 (P< 0.01);两治疗组间比较, 差异不明显(P > 0.05)。②血管紧张素Ⅱ含量:模型组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马明显高于假手术组(P < 0.01), 中、西药组明显低于模型组( P < 0.01) , 两治疗组间差异不明显 (P > 0.05)。③精氨酸加压素含量: 模型组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马明显低于假手 术 组 ( P < 0.01) ; 中 、西 药 组 明 显 高 于 模 型 组 ( P < 0.01) ; 中 药 组大脑皮质、下丘脑明显高于西药组( P < 0.05) , 在海马与西药组相近( P > 0.05) 。④相关性分析结果: 假手术组、模型组、中药组和西药组大鼠海马血管紧张素Ⅱ含量与主动回避反应比率呈负相关(r=- 0.894, - 0.872,- 0.928, - 0.880, P < 0.05) , 而上述各组大鼠海马精氨酸加压素含量与主动回避反应比率呈显著正相关( r=0.912, 0.892, 0.937, 0.897, P < 0.05) 。

结论: 步长脑心通改善血管性痴呆模型大鼠认知功能的作用可能是通过降低海马等脑组织血管紧张素Ⅱ含量、提高精氨酸加压素含量而实现, 作用效果与甲磺酸双氢麦角毒碱相当。

主题词: 痴呆, 血管性 /中药疗法; 血管紧张素Ⅱ; 精氨酸升压素; 认知障碍; 认知

引言

步长脑心通是以《内经》“五脏藏神”理论为指导,具有益气活血、化瘀通络、醒脑开窍、宣痹止痛之功效的中成药。本实验旨在观察步长脑心通对血管性痴呆模型大鼠认知功能及大脑皮质、下丘脑和海马血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量的影响, 为血管性痴呆寻求有效治疗手段, 探索中药治疗血管性痴呆的确切药理机制。

1 材料和方法

设计: 完全随机分组设计。

单位: 解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科。

材料: 实验于 2005- 07 /11 在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所七室( 国家重点实验室) 完成。选用清洁级老龄( 15～18 月龄) Wistar 大鼠 48 只,雌雄不拘, 体质量( 200±20) g, 由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供 ( 许可证号: SCXK( 渝) 2003- 0003) 。按随机摸球法将 48 只大鼠分为 4组: 假手术组、模型组、中药组和阳性对照组, 每组 12 只。每笼 6 只, 大鼠自由觅食喝水, 在室温(22±1) ℃、湿度( 50±5) %环境下喂养。

药物和试剂: 步长脑心通胶囊( 咸阳步长制药有限公司, 国药准字 Z20025001, 0.4 g/粒) , 由黄芪、乳香、没药、全蝎、地龙等 16 味中药组成。以生理盐水制成混悬液。喜得镇( 瑞士山德士药厂与天津华津制药厂合作生产, 批准文号: (91)卫药准字 X- 156 号, 1 mg/片, 生产批号: 970141) ,用生理盐水配成混悬液。血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素放射免疫分析法药盒分别购自中国同位素公司北方试剂研究所和解放军第二军医大学神经生物学教研室。

设计、实施、评估者: 实验设计为第一作者, 干预实施为全部作者, 主动回避反应和脑组织血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量检测为另二工作人员, 检测者不知晓动物分组情况, 均受过专业培训。

方法:

改良 Pulsinellis 四血管阻断法制作血管性痴呆模型: 除假手术组外, 其余大鼠用 10 g/L 的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 大鼠取颈前部正中切口, 钝性分离双侧颈总动脉, 穿 4 号线备用, 缝合颈部皮肤。然后取颈背部正中切口, 沿第一颈椎翼小孔烧灼双侧椎动脉,阻断血供 24 h 后, 再以微动脉夹反复夹闭双侧颈总动脉, 5 min /次, 间隔 1 h, 共 3 次。假手术组除不烧灼双侧椎动脉, 不夹闭双侧颈总动脉外, 其余处理同前。

给药方法: 中药组: 参照文献以 0.45 g/( kg·d)剂量灌胃步长脑心通混悬液; 西药组: 以 0.32 mg/(kg·d)剂量灌胃甲磺酸双氢麦角毒碱混悬液; 假手术组和模型组灌胃同容量生理盐水; 分早、中、晚 3 次。术后当天开始用药, 连续 8 周。

穿梭箱检查: 采用上海欣软信息科技有限公司提供的穿梭箱主动回避反应系统。该系统以声、光为条件刺激。如大鼠在条件刺激后即能完成穿梭动作称主动回避反应。大鼠的认知功能以完成主动回避反应的次数与测试总次数(20次)的比值即主动回避反应比率表示。术前大鼠行 7 d 的穿梭箱训练, 以主动回避反应比率≥ 80%入选, < 80%者淘汰;于术前, 术后 2, 4, 8 周行穿梭箱检查。

标本采集、处理及储存: 大鼠于给药结束后在无麻醉下快速断头、取全脑, 置沸生理盐水中煮 5 min 取出, 用滤纸吸干附着的液体后, 分离大脑皮质、下丘脑和海马, 分别称重后加入 1 mol /L HCl 1 m L, 匀浆后倒入塑料指形管中, 室温放置 100 min, 再加入 1 mol /LNa OH 1 m L, 4℃, 4 000 r /min, 离心 10 min, 取上清液, 置- 70 ℃ 冰箱保存待测。

指标测定: 采用放射免疫分析法 测定血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量。操作严格按药盒说明书进行,并根据标准曲线求得标本实际浓度。

主要观察指标: ①造模前后各组大鼠主动回避反应比率差异。②给药结束后各组大鼠不同脑区血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量比较。③给药结束后各组大鼠海马血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量与主动回避反应的相关性。

统计学分析: 计量结果采用 x±s 表示; 由第一作者采用SPSS 10.0 软件对数据进行单因素方差、均数间多重比较q 检验; 数据间相关性处理采用直线相关分析。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠 48 只, 造模过程中如有动物死亡则补充相应只数, 最终进入结果分析的大鼠保持为 48 只。

2.2 各组大鼠穿梭箱检查结果 见表 1。

 2.3 给药结束后各组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马血管紧张素Ⅱ含量比较 见表 2。

 2.4 给药结束后各组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马精氨酸加压素含量比较 见表 3。

 2.5 各组大鼠海马血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量与主动回避反应的相关性分析 假手术组、模型组、中药组和西药组大鼠海马血管紧张素Ⅱ含量与主动回避反应比率呈负相关( r=- 0.894, - 0.872, - 0.928,- 0.880, P < 0.05) , 而各组精氨酸加压素含量与主动回避 反 应 比 率 呈 显 著 正 相 关 ( r =0.912, 0.892, 0.937,0.897, P < 0.05) 。

3 讨论

血管性痴呆是由于反复脑缺血导致与认知活动相关的海马、皮质等结构不可逆的损害。从中医辨证的角度来看,系肾精亏虚、髓海失充、肝郁脾虚、痰阻血瘀、心脾亏损,复因情志失调、劳作失度, 或他病累及而引发肝风, 风挟痰瘀, 血苑于上, 发为本病; 其中肾虚血瘀是关键。步长脑心通由黄芪、乳香、没药、全蝎、地龙等16 味中药组成, 立法方义就是补肾活血、化瘀通络, 且能扶正固本、攻补兼施、标本同治, 使瘀散血行气畅,心脑脉络得以濡养, 可列为治疗血管性痴呆首选中成药。

本实验采用电脑控制的穿梭箱系统对各组大鼠进行行为学测试, 发现模型组大鼠造模后 2, 4, 8 周主动回避反应比率均明显低于假手术组(P < 0.01); 中、西药组虽明显低于假手术组 P < 0.01), 但均明显高于模型组(P < 0.01);两治疗组间则无明显差异(P > 0.05)。表明慢性脑灌注不足可引起大鼠认知功能损害, 而步长脑心通与西药甲磺酸双氢麦角毒碱疗效相当, 对脑组织细胞起到修复营养作用,并显著改善血管性痴呆大鼠认知功能。

血管紧张素Ⅱ和精氨酸加压素是具有生物活性的多肽, 不仅在血液中起着类似循环激素的作用, 而且在中枢神经系统中发挥着神经递质的作用, 参与脑的高级神经功能, 与学习记忆密切相关。海马及其周围皮质是外显记忆神经通路的重要组成部分。因此,在探讨血管性痴呆发病机制、干预治疗、药物筛选及评价中检测不同脑区血管紧张素Ⅱ和精氨酸加压素的含量变化, 近年来日益受到人们的关注。

除肾素- 血管紧张素系统外, 脑内存在局部肾素-血管紧张素系统。血管紧张素Ⅱ是脑内肾素- 血管紧张素系统的主要效应物质, 在下丘脑含量最高, 大脑皮质、边缘系统含量也相当丰富。长时程增强是学习、记忆储存的功能单位,

在海马齿状回 CA1 到 CA3 区均有习得性长时程增强的突触效应。Wayner 等发现将血管紧张素Ⅱ直接注入海马背侧, 可抑制长时程增强的产生; 如提前注入选择性血管紧张素受体亚型 1的拮抗剂, 则可阻断此反应。近年来又证实脑室注入血管紧张素Ⅳ或其受体激动剂可易化长时程增强, 显著改善大鼠记忆的获取、保留和再现。本实验结果表明, 模型组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马血管紧张素Ⅱ含量显著高于假手术组(P < 0.01), 中、西药组较模型组则有明显下调趋势( P < 0.01) 。揭示在血管性痴呆的发病中, 脑缺血、缺氧可能干扰了中枢肾素- 血管紧张素系统, 引起某些核团神经元及其交感神经活动增强, 导致脑内血管紧张素Ⅱ含量持续显著升高,进而影响了认知功能; 同时表明步长脑心通与西药组一样可通过改善脑血液循环、保护脑组织, 使受损的神经元得以修复, 从而调节血管紧张素Ⅱ的分解、合成与释放, 对血管性痴呆有显著的改善作用。

精氨酸加压素是由下丘脑合成和分泌的环状九肽, 其神经元主要存在于室旁核与视上核, 但其神经纤维广泛分布于下丘脑、丘脑、纹状体、海马、皮质等区域。在大鼠的杏仁核、海马背侧及脑干可以测得精氨酸加压素受体, 精氨酸加压素可通过与其相应受体结合而发挥作用。近期研究发现精氨酸加压素可抑制突触前膜摄取 γ- 氨基丁酸, 间接延长 γ- 氨基丁酸对突触后膜 γ- 氨基丁酸受体的作用; 精氨酸加压素 4～8 可促进谷氨酸摄取, 有利于谷氨酸依赖的长时程增强产生，具有明显增强记忆, 减少遗忘的作用。本实验显示模型组大脑皮质、下丘脑和海马精氨酸加压素含量显著低于假手术组( P < 0.01) , 中、西药组较模型组则有明显上调作用( P < 0.01) ; 揭示脑内精氨酸加压素含量变化与大鼠认知功能密切相关。一方面说明脑内精氨酸加压素活性变化参与了血管性痴呆的发病过程, 其机制可能与精氨酸加压素对海马儿茶酚胺、乙酰胆碱的代谢及其突触参数的可塑性调节有关, 即精氨酸加压素降低可抑制其特异性受体的活性, 干扰了一系列与学习、记忆相关的中枢神经递质代谢; 另一方面说明中西药治疗可改善中枢递质精氨酸加压素的紊乱, 对神经突触传递和认知功能发挥积极的调控作用。另外还发现中药组大脑皮质、下丘脑内精氨酸加压素含量明显高于西药组( P < 0.05) , 中药组海马精氨酸加压素含量略低于西药组, 但差异不明显( P > 0.05) 。提示中药步长脑心通对大脑皮质、下丘脑的精氨酸加压素作用优于西药, 对海马精氨酸加压素作用与西药相当。

大脑的边缘系统尤其是海马在信息整合、储存和传导过程中起着至关重要的作用, 对维持机体正常的学习记忆是不可缺少的。近年研究发现海马 CA1区神经细胞的凋亡与丢失是血管性痴呆形成的病理学基础。本实验中, 慢性脑缺血、中西药治疗使脑组织不同区域血管紧张素Ⅱ、精氨酸加压素含量明显降低或增多, 大鼠主动回避反应比率也出现相应显著性改变, 其中海马内神经递质变化与主动回避反应比率尤 为 密 切 , 呈 显 著 直 线 ( 正 或 负 ) 相 关 ; 揭示海马的这些神经肽代谢对维持或改善学习记忆功能更为关键, 充分体现海马在学习记忆功能方面的重要生物学意义。总之, 步长脑心通治疗血管性痴呆的机制可能是通过降低海马等脑组织血管紧张素Ⅱ含量、提高精氨酸加压素含量而实现, 但其确切机制有待进一步深入研究。

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