丹栀逍遥散对天敌暴露饮水冲突模型大鼠行为学变化的影响

内容

丹栀逍遥散对天敌暴露饮水冲突模型大鼠行为学变化的影响

【摘要】目的 测评天敌暴露饮水冲突模型大鼠行为学变化特征及丹栀逍遥散的干预效果。方法 以天敌暴露饮水冲突刺激法建立广泛性焦虑大鼠模型，造模同时进行药物干预，应激结束后以高架十字迷宫实验进行测评，综合评价该模型大鼠的行为学变化及丹栀逍遥散的干预效果。结果 造模结束后大鼠运动活力降低，易激惹，高架十字迷宫测试开放臂活动次数减少，封闭臂活动次数增多( P ＜0. 01) 。中药治疗组较模型组运动活力提高，开放臂活动次数及时间增多，封闭臂活动次数及时间减少( P ＜0. 01) 。结论 天敌暴露饮水冲突模型大鼠在行为学上表现出明显的焦虑，丹栀逍遥散可降低该模型大鼠的焦虑水平。

【关键词】天敌暴露饮水冲突模型; 广泛性焦虑障碍; 行为学; 丹栀逍遥散

 

广泛性焦虑障碍( generalized anxiety disorder，GAD) 是以恐惧、担忧、紧张不安等持续的、弥散的、伴有强烈不确定感甚至漂浮感的焦虑情绪为核心症状的慢性焦虑障碍，常伴精神运动性不安和自主神经功能紊乱。随着现代社会工作、生活节奏加快，GAD 发病率日趋升高。本研究采用天敌暴露饮水冲突应激方法建立广泛性焦虑大鼠模型，并通过对大鼠行为学变化的观察，对中药丹栀逍遥散的干预作用进行测评。报告如下。

1 材料

1. 1 实验动物

健康雄性 Wistar 大鼠 48 只，SPF 级，10 周龄，体重( 200 ±10) g，购自北京维通利华实验动物技术 有 限 公 司，合 格 证 号 SCXK ( 京) 2010-0001。动物购进后饲养于 SPF 级实验动物中心，自由摄食饮水，12 h 明暗交替，室温( 20 ± 2) ℃，相对湿度 50% ～60%，保持安静。

1. 2 实验器材

高架十字迷宫( 型号 XＲ-XG201) ，旷场场箱( 型号 XＲ-XZ301) ，动物行为学视频分析系统( 型号 XＲ-Xmaze) ，吮水电击实验系统( 型号 XR-XY211),均由上海欣软信息科技有限公司生产。

1. 3 实验用药

丹栀逍遥散( 柴胡 15 g，栀子 10 g，牡丹皮10 g，炒白术 15 g 等) 由北京中医药大学第三附属医院提供，按大鼠用量 10. 5 g/( kg·d) 、灌胃剂量每次 2mL 煎煮，煎取后 浓 缩 至 生 药 浓 度1. 05 g / mL，贮存于 4℃ 冰箱冷藏备用，灌胃前以温水隔水加热。盐酸丁螺环酮片( 江苏恩华药业股份有限公司，国药准字 H19991024) ，按成人用量20 mg / ( 70 kg·d) 的 7 倍、灌胃剂量每次 2mL 计算大鼠用量 2. 0 mg/( kg·d) ，以浓度 0. 20 mg/mL溶于蒸馏水中，灌胃前混匀。

2 方法

2. 1 动物分组与给药

48 只大鼠适应性饲养 1 周后，首先进行旷场试验，以大鼠水平运动( 水平运动总格数) 与垂直运动( 直立次数) 之和为参考，按正态分布去掉置信区间 95%以外的 8 只大鼠，剩余 40 只按水平运动与垂直运动之和随机分为正常组、模型组、西药对照组、中药治疗组，每组 10 只。自造模第 1天起，正常组不予任何处理，自由摄食、饮水，模型组予蒸馏水灌胃，西药对照组予盐酸丁螺环酮溶液灌胃，中药治疗组予丹栀逍遥散浓缩药汁灌胃，连续 21 天。

2. 2 模型制备

大鼠适应性饲养及分组结束后，模型组、西药对照组、中药治疗组与灌胃同步进行天敌暴露饮水冲突模型制备。模型制备分 2 种方式进行应激，2 种应激每天使用 1 种，交替使用 20 天。( 1)饮水冲突应激: 大鼠先剥夺饮水 24 h 后再允许饮水，每当舔吸水管口达 20 次就给予 1. 2 mA 电流令其遭受电击，电流来自于鼠笼底部有导电功能且与电击控制设备相连接的金属栅栏。每次应激持续时间 3 min。应激时由 3 名观察者观察并记录大鼠应激期间饮水次数，以 3 位观察者观察结果的平均数作为饮水冲突应激时饮水次数的值。( 2)天敌暴露应激: 以猫作为本实验用于对大鼠造成威胁的天敌，实验用猫每日仅进食 30 g 小鼠 1 只，确保在实验中处于饥饿状态，维持其对大鼠天然的攻击性。在大鼠进行饮水冲突的次日进行天敌暴露应激，应激时将大鼠以每笼 1 只置于猫笼内，将猫引入猫笼，猫可在笼内自由活动，大鼠暴露于猫每次 45 min。模型制备期间，3 组大鼠应激操作均于每日 8: 00 am ～11: 30 am 进行，应激前 3组大鼠提前 30 min 进入实验室适应环境，操作时抓取动物保持轻柔。

2. 3 高架十字迷宫测试

行为学实验室保持安静通风，恒温 22 ℃，湿度 50% ～ 60%，室内暗光，光线自天花板反射入迷宫测试区。迷宫由两个开放臂( 50 cm ×10 cm) 、两个封闭臂( 50 cm ×10 cm ×40 cm) 、一个连接四臂的中央平台( 10 cm ×10 cm) 组成，开放臂与封闭臂互相垂直成 “+ ”形，围绕开放臂边缘有1 cm 高挡板，防止动物滑下迷宫。测试前动物提前 60 min 进入测试房间适应环境，测试时由固定实验人员轻柔抓取大鼠并迅速放入中央平台处，放置时使大鼠头部正对其中一个开放臂，释放后摄像开始，每只大鼠测试 5 min，各组交叉进行，测试时摄像视频系统记录大鼠行为表现，实验者通过显示器观察大鼠迷宫上的活动，每只大鼠测试结束后将排泄物清除干净，并以酒精擦拭迷宫底部，以免影响下只大鼠行为表现。高架十字迷宫测试于造模结束次日3: 00 pm ～6: 00 pm 进行，所有大鼠测试结束后，统一分析视频，记录并整理大鼠进入开放臂次数及时间、进入封闭臂次数及时间、探头次数、直立次数、修饰次数、排便次数，并计算进入开放臂与封闭臂次数之和、进入开放臂次数占总次数百分比、进入开放臂时间占总时间百分比。

2. 4 统计学方法

数据采用 SPSS18. 0 统计软件进行数据分析，计量资料用均数 ± 标准差( x珋 ± s) 表示。组内比较采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性检验后多重比较采用 LSD 法。P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。

3 结果

3. 1 造模期间大鼠一般情况

根据肉眼观察，天敌暴露期间的大鼠在面对天敌威胁时表现出焦虑样行为，如四处逃窜、行动减少、蹲伏、瑟缩发抖、动作僵硬、排泄粪便增多等; 而饮水冲突应激期间大鼠被电击后表现出短暂的僵滞、毛发直立或逃跑、尖叫，电击后再饮水时表现出退却、犹豫。

3. 2 造模期间大鼠饮水次数

模型制备过程中，模型组、西药对照组、中药治疗组大鼠每次饮水冲突应激后的再次应激均表现出比上次应激时饮水次数减少( P ＜ 0. 01) ，3组饮水次数第 1 ～20 天组间比较差异无统计学意义( P ＞0. 05) 。模型组与中药治疗组、西药对照组与中药治疗组第 1 ～20 天饮水次数组间比较差异无统计学意义( P ＞0. 05) 。模型组与西药对照组比较第1 ～ 19 天组间比较无差异，第 20 天西药对照组较模型组饮水次数增多( P ＜0. 05) 。见图 1。

 

             图 1 天敌暴露饮水冲突模型各组大鼠应激时饮水次数

3. 3 造模结束后一般情况及体重变化

造模结束后肉眼观察 4 组大鼠神态、毛发、饮食、粪便性状。模型组、西药对照组、中药治疗组均较正常组神态懒倦，毛发枯弱无泽，饮食欠积极，活动欠活跃，易激惹，少数大鼠见溏便。造模第 1、2、3、4 天 4 组大鼠体重无差异，第 5天起至造模结束，正常组与模型组、西药对照组、中药治疗组比较差异有统计学意义( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，其中第 6 天起差异明显，正常组高于其余3 组，差异有统计学意义( P ＜ 0. 01) ; 第 8 天起至造模结束，西药对照组体重高于模型组( P ＜0. 05，P ＜ 0. 01) ，第 7 天起至造模结束，中药治疗组体重高于模型组，差异有统计学意义( P ＜0. 01) ; 第10 天起至造模结束，中药治疗组体重高于西药对照组，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，且自第 12 天起至造模结束差异明显，差异有统计学意义( P ＜0. 01) 。见图 2。

                图 2 天敌暴露饮水冲突模型大鼠体重变化

3. 4 高架十字迷宫测试结果

开闭臂活动总次数、开臂活动次数所占比例、开臂活动时间所占比例 4 组间比较，模型组、西药对照组、中药治疗组均较正常组减少，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ; 西药对照组、中药治疗组均较模型组增多，差异有统计学意义( P ＜0. 05，P ＜ 0. 01) ，但 2 组间差异无统计学意义( P ＞0. 05) 。见表 1。

 

与正常组比较，模型组、西药对照组、中药治疗组探头、直立次数均减少，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修饰、排便次数 4 组比较差异无统计学意义; 西药对照组、中药治疗组探头、直立次数均较模型组增多，差异有统计学意义( P ＜0. 05，P ＜ 0. 01) ; 中药治疗组探头、直立、修饰、排便次数与西药对照组比较差异无统计学意义( P ＞0. 05) 。见表 1。

4 讨论

天敌暴露饮水冲突模型由天敌暴露模型与Vogel 饮水冲突模型结合并改进而成。天敌暴

露可以激发动物意欲逃跑却不能逃跑的心理冲突，进而诱发其焦虑情绪; 饮水冲突令动物在渴求饮水时遭遇电击，使动物产生趋避冲突，形成渴望饮水又担心电击发生的焦虑情绪。模型制备过程中动物应激期间的饮水次数可以反映实验动物对电击记忆的程度以及焦虑水平。行为学测试方法选用国际公认的高架十字迷宫试验，对该模型大鼠的行为学变化进行综合测评，同时观察丹栀逍遥散对该模型大鼠焦虑状态的干预效果。

模型制备期间对饮水次数的观察显示，模型组、西药对照组、中药治疗组大鼠随应激次数增多，表现出饮水次数减少，提示盐酸丁螺环酮和丹栀逍遥散均对大鼠饮水次数的干预未见阳性效果; 西药对照组与模型组第20 天的比较有差异，提示盐酸丁螺环酮对该模型饮水次数有干预趋向，但未表现出明确的干预效果。模型制备结束后的大鼠毛发枯弱无泽、易激惹、运动活力降低，随应激时间的延长体重与正常组的差异愈加明显，模型组体重明显低于正常组，盐酸丁螺环酮和丹栀逍遥散均表现出对体重的良性干预，而丹栀逍遥散较盐酸丁螺环酮起效早，且对体重的干预效果优于盐酸丁螺环酮。

高架十字迷宫测试中模型组、西药对照组、中药治疗组开放臂活动次数及时间相对减少，提示模型大鼠焦虑状态明显。直立次数是大鼠运动活力的指标，直立次数减少提示模型组大鼠运动活力降低。修饰次数是大鼠焦虑水平的指标之一，本研究中修饰次数无差异考虑可能与动物处于高架探究行为较多而致修饰次数被掩盖有关。模型组探究行为较正常组减少，大鼠探究动机降低是焦虑的表现之一。盐酸丁螺环酮与丹栀逍遥散均可提高开放臂活动倾向，增加大鼠直立和探究次数，降低大鼠焦虑水平，二者干预效果未见差异。

中医学并无 GAD 的病名，依据病因及临床表现，将其归为情志病范畴。中医学认为该病病位主要在肝、心、脾、肾，病理因素为火、痰、湿、瘀多种，所涉证型有肝郁化火、心肾不交、肝郁脾虚、心脾两虚等，其中肝郁化火证型尤为常见。临床所见 GAD 患者往往伴神疲、乏力、倦怠、纳减等脾虚表现，根据五行 “木克土” 及“见肝之病，知肝传脾”理论，GAD 属肝郁者往往伴有或引发脾虚，结合有关证型研究，选用疏肝清热健脾作为治疗原则。丹栀逍遥散以逍遥散加牡丹皮和栀子而成方，功可疏肝健脾、清热解郁。李宁等以不确定性空瓶刺激建立 GAD 模型，以丹栀逍遥散进行干预，结果显示丹栀逍遥散抗焦虑效果优于丁螺环酮，与本研究结果有异，考虑可能与 GAD 模型应激方式不同有关，也可能与丁螺环酮给药天数不同致起效不同有关。

总之，通过天敌暴露饮水冲突应激的方法建立 GAD 模型，可以造成大鼠的焦虑状态，虽然饮水冲突阶段的电击对实验动物有躯体刺激，但在其他应激时间均避免了躯体应激成分。GAD 的发病就社会心理因素而言，多由趋避冲突、双趋冲突或双避冲突等冲突心理诱发，且往往以各种心理冲突为临床表现。天敌暴露和饮水冲突均可造成动物强烈的逃跑不能和意欲饮水却顾虑电击的冲突心理，从疾病发生的角度出发，能够较好地模拟 GAD 的发病状态。丹栀逍遥散与盐酸丁螺环酮在行为学上均表现出肯定的抗焦虑效果，前者在动物整体体质状态改善方面效果更优。但有关GAD 实验动物模型具体的神经病理改变和中药作用机制及相关作用靶点仍有待更深入的研究。