脊髓损伤(SCI)是一类严重影响人类健康的疾病，指由各种原因造成的脊髓损害并引起的脊髓功能障碍。各种因素导致的脊髓损伤在临床上越来越多见，是患者身体和精神双方面严重受影响的一类疾病，尤其是因各种原因引起的截瘫，给患者造成了严重的神经功能障碍，导致患者的生存质量明显下降，给社会和家庭带来沉重的负担。随着交通运输的高速化、体育运动的极限化及暴力伤害的出现，现代SCl呈现出高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率和患者主要为青壮年等特点。脊髓损伤所致的截瘫，其典型的临床表现为痉挛性截瘫，主要是因为伤后皮质脊髓束、红核脊髓束等下行传导束的纤维损伤，受损平面以下脊髓运动神经元失去了上位神经的支配和控制。就目前的临床医疗技术来说，欲使其功能完全恢复几乎是无望的。从1958年，Liu和Chamber证实成年哺乳动物SCI后仍具有可塑性(plasticity)之后，人们就SCI后的修复进行了大量的研究。

研究表明。啮齿类及低等哺乳动物SCI后有较强的修复能力，而人类SCI后的再生修复能力十分有限。所以截至目前还没有一种与人类SCI最为接近的动物模型。一直以来，国内外用于SCI的实验研究主要集中在脊髓撞击伤、压迫伤、缺血损伤及横断伤等损伤模型上。由于对SCI后的病理生理机制的认识有限和神经元损伤后再生障碍，因此SCI的治疗仍缺乏行之有效的治疗措施。建立理想的动物模型是SCI研究的前提，理想的动物模型能够促进SCl基础研究知识的更新与发展，为临床研究提供更好的治疗建议。所以现阶段，确立理想的标准化SCI实验动物模型非常必要。

目前，要建立一个重复性好、标准及理想的SCI动物模型应具备以下因素：

①实验动物的选择：主要考虑两方面，即生物学特性接近人类、动物来源及其价格。从解剖生理学上讲，进行SCI研究最理想的实验动物是灵长类，如猿、猩猩、猴等，因为越是高等的动物就越接近人类，就越容易和可靠地观察脊髓损伤后的功能改变，即行为学变化及其恢复情况；且这类动物体型大，在手术操作实感上也与人极为相似。但价格昂贵，难以获得，故难被推广使用。目前国内外SCI实验研究最常选用的动物为大鼠，大鼠成本低、种系内纯合性好、基因学和生理特性较为接近人类。②损伤可控性：即损伤程度可以自由控制，用相同的实验方法、不同程度的致伤量作用于脊髓同一节段产生的伤害量与损伤程度呈线性关系，以便复制出不同损伤程度的脊髓损伤模型。③脊髓节段的选择：一般根据临床脊髓损伤部位及研究需要，可选用颈髓、胸髓或腰骶髓。在SCI模型制作过程中大多选择胸段脊髓，一般常见的为T8～T12节段，因其操作方便并且可以让动物自行进食而提高动物存活率。④可重复性：可以对SCI模型制作过程定量化、客观化、标准化，使其可行度高、可实施性强，并且可以多次重复操作。

综上所述，目前用于SCI实验研究的动物有多种，国内外较常用的SCI实验性动物模型主要为大鼠、小鼠及猴，以低等啮齿鼠类的模型最为常见，运用也最为广泛。从动物费用和易操作、易管理方面，大鼠、兔等低级哺乳动物是常被选用的，但在脊髓解剖、生理功能与人类接近程度方面，以及在观察截瘫肢体恢复功能的难易和可靠性方面，猿、猴站立者最好。非人灵长类高级生物(nonhuman primate, NHP)，如恒河猴、食蟹猴、狒狒、松鼠猴等，由于其在进化上的特殊地位，与人类神经生物学特性最为相似，成为神经医学特别是SCI疾病研究的理想实验动物模型。NHP较啮齿类更好地表现了脊髓损伤后的行为表现，而且NHP可以训练用于完成特定的与记忆有关的任务，用于评价认知能力、情绪行为等神经精神心理的变化，这也是啮齿类动物无法替代的。但是，由于猴类价格高昂，实验成本倍增，且实验操作难度较大。不易获得，因此NHP模型制作还不够完善，远远不能满足疾病研究的需求，因此，开发新的NHP动物模型就显得尤为重要。

恒河猴属于非人灵长类动物中的一种，别名猕猴、黄猴、广西猴，属于猴科，学名为 Macaca mulatta。体长43～5cm，尾长15～24cm。头部呈棕色，背上部棕灰或棕黄色，下部橙黄或橙红色，腹面淡灰黄色。鼻孔向下，具颊囊。臀部的胼胝明显。营半树栖生活，多栖息在石山峭壁、溪旁沟谷和江河岸边的密林中或疏林岩山上，群居，一般30～50只为一群，大群可达200只左右。分布于西南、华南、华中、华东、华北及西北的部分地区，地域范围十分广泛，西到青海南部，北至河北兴隆县，南达海南岛，都能见到它们的活动踪迹。恒河猴适应性强，容易驯养繁殖，生理上与人类较接近，因此是生物学、心理学、医学等多种学科研究工作中比较理想的实验动物。并且其形态解剖、生理功能与人类相似，其基因与人类的基因同源性达92.5％～95％，脑的结构和功能与人类最为相似，神经系统结构和组织与人类相似。建立的损伤模型产生的症状、体征与人类基本一致。因此，建立恒河猴SCI标准模型，可以为人类脊髓损伤和治疗措施的研究提供重要的基础。本节主要介绍恒河猴脊髓全横断模型的建立及行为学评估。

一、实验动物及分组

成年雄性恒河猴(18～19岁，5.5～6kg，昆明医科大学实验动物中心提供)，按照阿拉巴马大学伯明翰分校实验动物护理与使用委员会(IACUC)协议进行动物的饲养和安乐死，且所有实验均在9：00～14：00进行。所有动物经行为学实验合格后随机分为两组：脊髓全横断损伤组(于第11胸髓节段横断脊髓，n=3)及假手术对照组(剪开硬脊膜不损伤脊髓，n=3)。研究者每日需与恒河猴进行至少1h以上的接触，消除灵长类实验动物对研究者的敌对与警觉情绪。

二、实验所需试剂及器材

实验所需试剂及器材包括：阿托品，2ml/只；盐酸氯胺酮，2ml/只；头孢噻肟钠，2g/只；庆大霉素，2ml/只；注射用头孢拉定，1g/只；速眠新Ⅱ，1.5ml/只；苏醒灵3号，2mL/只；0.9％氯化钠注射液(NS)，50ml/瓶；PBS，1L/包；碘伏，500ml/瓶；婴儿理发器；牙科钻；计时器；智能恒温培养箱；不锈钢灭菌器；一次性注射器；一次性乳胶手套；帆布手套；手术刀柄；骨膜剥离器；止血钳；无损伤镊；组织镊；自动撑开器；椎板咬骨钳；单关节咬骨钳。

三、恒河猴脊髓全横断损伤模型的制备

为防止麻醉过程中出现严重呼吸道反应，先于手臂三角肌注射0.5ml阿托品(0.5g/ml)，后于三角肌注射0.4ml盐酸氯胺酮(0.1g/2ml)。盐酸氯胺酮0.1g/2ml、速眠新1ml/支、阿托品0.5g/ml按照2：1：1的体积比混合，称重，并按0.15～0.2ml/kg肌内注射补麻，将恒河猴俯卧位固定于手术台。按无菌操作规程，常规备皮(用婴儿理发器剃除恒河猴背部毛发，并用碘伏进行消毒)。将已备皮的恒河猴俯卧固定于手术台，并定位 T11，髂嵴连线横对T6～T7椎间隙或从颈椎向下触及棘突最长者为T11，以T11为中心，碘伏消毒，消毒铺巾，行后正中切口，长约5cm，逐层切开背部皮肤、皮下组织、胸背筋膜，切开椎旁肌棘突附着处，骨膜剥离器于椎板骨膜下剥离椎旁肌至关节突部，干纱布填塞止血。自动撑开器牵开椎旁肌，清理椎板及棘突旁残余的软组织，用单关节咬骨钳咬除T10～T12的棘突，切开T11棘上韧带和棘间韧带，剪除棘突及切开黄韧带，用椎板咬骨钳咬开椎板，暴露脊髓，可见脊膜搏动。切开硬脊膜和蛛网膜，并用圆针穿线分别在左、右侧硬脊膜各缝两针，线头留得稍长些，以便牵拉用。悬吊硬脊膜并切开背侧，切开硬脊膜和蛛网膜(注意不要切到血管)。以脊髓后正中血管为标志，用锋利刀片自脊髓后正中裂迅速轻划至脊髓，注意保护后正中动脉，用明胶海绵止血，左、右后肢呈现软瘫，刺激无反应后，清除淤血，缝合硬脊膜。用0.9％NS冲洗，用头孢噻肟钠1g(用5ml 0.9％NS稀释)冲洗。分层缝合(肌层间断缝合、筋膜层间断缝合、内皮层连续缝合、外层间断缝合)。缝合完毕后用碘伏消毒，并穿上高温消毒后的小衣服。于大腿内侧静脉滴注100ml 5％GS+100ml 0.9％NS+1g头孢噻肟钠。并将动物置于37℃环境并观察其呼吸、体温等情况，待其苏醒后放回恒河猴饲养笼，2h后喂水、喂食。术后给予抗生素治疗：头孢拉定0.5g，每日3次；庆大霉素80万U，每日3次，治疗3～5d。术后5～7d全水果喂养。术后需随时严密观察，记录动物精神状态、饮食、排尿、排便、有无肢体水肿和压伤、有无泌尿系统的分泌物等情况，以便及时处理。假手术组打开椎管，切开硬脊膜后不行脊髓全横断手术，随后逐层缝合伤口，术后护理同手术组。

四、模型的评估

(一)后肢运动功能评价(Tarlov评分法)

观察手术前、手术后24h、7d肢体自主运动、肌力变化。双后肢运动评价依据Ducker等改良的Tarlov评分法(表13-1)。

(二)体感诱发电位的测定

采用丹迪(Dantec)诱发电位仪记录。参数设置如下：刺激频率3Hz，刺激方波时程0.3ms，刺激强度1.9mA。参照人类SEP检测和记录的方法，在室温25℃的实验室中，将参考电极置于恒河猴前额正中，刺激电极分别位于前臂手腕(正中神经)和内踝(胫后神经)，记录电极位于头部额顶皮质感觉区，刺激频率3Hz，刺激强度1.9mA，分析时间50ms，每次检查基本波形稳定且重复3次后描记结果。前肢基本波形为P-N波，观察P波潜伏期和P-N波幅改变。后肢基本波形为P1-N1-P2波。观察P1潜伏期和P1-N1波幅改变。潜伏期和波峰幅度测量方法：潜伏期是指从刺激开始到第一个波峰起始点之间的时间间隔。波峰幅度是指从相应波负极波峰到随后的正极波峰间的电压差值。每只动物分别于术前、术后24h、7d进行测定，观察测量潜伏期和波幅变化。

五、实验结果

(一)运动功能的测定

根据改良的Tarlov评分方法，观察记录手术前、手术后24h、7d肢体自主运动和肌力变化。结果显示，手术组手术前左侧后肢评分为6级，右侧后肢评分为6级；手术后24h左侧后肢评分为0级，肌张力下降，表现为弛缓性瘫，右侧后肢为0级；手术后7d，左侧后肢为0～1级，右侧后肢运动功能评分逐渐恢复至0～2级；假手术组手术前左侧后肢评分为6级，右侧后肢评分为6级；手术后24h左侧后肢评分为5级，肌张力下降，右侧后肢为4～5级；手术后7d，左侧后肢为5～6级，右侧后肢运动功能评分逐渐恢复至5～6级(表13-2)。

(二)体感诱发电位的测定

为了进一步检测脊髓横断是否完全，分别于术前、术后24h、7d进行SEP测定，观察测量潜伏期和波幅变化。结果显示，术后24h脊髓全横断组SEP未检出，而假手术组与术前相比潜伏期略有延长，波幅略有下降，但均无统计学差异(P>0.05)。术后7d，脊髓损伤组与假手术组相比潜伏期明显延长(P<0.01)，波幅明显降低(P<0.01)(图13-1)。

六、术后常见并发症和相对应的措施

动物死亡：高死亡率是脊髓全横断模型最严重的问题。恒河猴脊髓全横断后如不采取有效护理的措施，则死亡率会较高，脊髓全横断后影响实验动物存活的主要因素有：①泌尿系统感染；②尿潴留；③患肢受压水肿、压疮。恒河猴脊髓全横断后的死亡率主要与损伤的严重程度和术后护理的质量有关系，提高手术操作的精细程度，减少术中出血，加强实验动物术后护理可以降低术后死亡率。

感染：实验动物的感染主要是泌尿系统感染和手术切口感染。因此，在动物实验过程中同样应该严格坚持无菌原则及术后应用抗生素预防感染等。在国内外的文献中抗生素的使用类型和剂量尚无统一的标准，在国内以使用青霉素和庆大霉素较多，具体的用药剂量、给药途径也不一致。

低体温：全身麻醉、长时间的手术暴露、术中出血及体液的丢失引起血容量不足等都是导致实验动物术后低体温的原因，体温过低又可能进一步引起动物死亡。另外，术中精细操作以减少出血、提高手术熟练程度以缩短手术时间及术后补液等都是减少此并发症的重要措施。

尿潴留：大鼠脊髓全横断术后几乎都会发生尿潴留。尿潴留及其并发症是导致实验动物术后死亡的第1位原因，可占总死亡原因的50％以上。因此，人工挤压膀胱排尿便成为动物术后护理的重要内容。

另外，术后还可能发生下肢水肿及压迫性溃疡等并发症，在护理时必须要时刻预防并发症的发生，这有助于提高模型的存活率。

七、注意事项

(1)恒河猴是一种应激性极强的动物，所以每只动物需单独饲养，且在整个实验中一定要固定饲养环境，不可随意更换。

(2)必须注意，在进行恒河猴全横断模型手术前一天禁食禁水。

(3)在实验前应对所有恒河猴进行行为学实验的训练及测试，筛选出合格的动物进行实验分组，以确保实验的可靠性。

(4)手术者必须要保持术前每天和恒河猴接触1h，避免产生一些其他因素对实验造成干扰。

(5)本实验采用盐酸氯胺酮0.1g/2ml、速眠新1ml/支、阿托品0.5g/ml复合麻醉，术后再注射苏醒灵(可对抗速眠新)，这样可以降低动物的死亡率。

(6)术后腹腔注射青霉素预防感染，注射时使动物头部朝向地面倾斜45°，进针后回抽。见空气后方可按剂量进行注射。若出现血性或其他液体(尿液可能)，则退针重新进行注射。