一、实验目的

探索建立准确与可靠的大鼠脊髓全横断损伤模型，并应用BBB评分、甩尾实验和苏木精-伊红染色(HE染色)等手段评估此模型，并观察脊髓可塑性。

二、实验原理

SCI后轴突再生与修复研究是神经科学领域研究的热点和难点，其动物模型有不全损伤和完全损伤两种。成年哺乳动物脊髓半横断后。由于对侧正常神经的代偿作用或半横切不完全以至难以保证手术的一致性，往往影响对实验结果特别是脊髓功能恢复的判定。完全性脊髓损伤是一种较为稳定、可靠的模型，常采用全横断术，即用锋利的刀片沿椎管内侧骨壁切断脊髓，可避免上述半横断术不利因素，且瘫痪症状直接归纳于脊髓横断这种原发损伤，瘫痪恢复与否完全取决于脊髓能否及在多大程度上修复再生，因此大鼠脊髓全横断损伤模型不失为研究脊髓损伤与修复的理想动物模型。

三、实验材料与方法

(一)实验材料

1.主要实验仪器、器械及耗材

(1)所需设备：剃毛器；电热恒温干燥箱；普通光学显微镜；恒温冷冻切片机；甩尾测试仪。

(2)实验器械：眼科剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、持针器、小三角针、血管钳、钝头的钩针、4号和7号缝针等。

(3)实验耗材：5ml一次性灭菌注射器、灭菌棉球、一次性灭菌铺巾、3-0灭菌手术缝线、10-0丝线。

2.试剂及配制

(1)0.2mol/L磷酸缓冲液(PB)

A液：NaH2PO4·2H2O(相对分子质量为136.08)27.6g，加双蒸水至1000ml。

B液：Na2HPO4·12H2O(相对分子质量为358.14)71.628g，加双蒸水至1000ml。

取A液19ml，B液81ml，充分混合，用HCI、NaOH调整pH至7.4左右，室温保存。

(2)0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)：取NaCl 9g及0.2mol/L PB 50ml加入1000ml容量瓶中，加双蒸水至1000ml，充分摇匀。

(3)4％中性多聚甲醛固定液(pH 7.4)：多聚甲醛20g，0.1mol/L PB(pH 7.4)500ml，两者混合加热至60℃。滴加1mol/L NaOH数滴，搅拌溶液至清亮为止，冷却后加0.05mol/L PBS至总量1000ml。

(4)20％和30％蔗糖溶液(pH 7.4)：分别取蔗糖20g和30g，用0.01mol/L PBS溶解，定容至100ml。

(5)1％伊红溶液：称取伊红Y 1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰乙酸直至糨糊状。

用滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95％乙醇100ml溶解。

(6)苏木素染液：将苏木素(6g)溶于无水乙醇(100ml)，再将硫酸铝钾(150g)溶于蒸馏水(2000ml)，溶解后将甘油(900ml)倾入一起混合，最后加入冰乙酸(120ml)和碘酸钠1.2g。

(7)1％盐酸乙醇分化液：将1ml浓盐酸加入99ml 70％乙醇中即可。

(8)其他：如生理盐水、碘伏、青霉素、乙醇、二甲苯(直接购买)。

注：以上所有试剂均常温保存。

(二)实验具体方法和操作步骤

1.实验动物的选择和分组  本实验动物选用雌性野生型健康大鼠(昆明医科大学实验动物中心提供)，体重180～220g，7月龄。随机分为两组：脊髓全横断组、假手术组，每组动物数十只，动物自由饮食。室温22～25℃。

关于实验动物性别的选择。研究发现术后大鼠死亡率与性别无关，但由于雌雄大鼠尿路解剖学特点的不同，雄性大鼠泌尿系统并发症明显高于雌性。也有学者研究了脊髓全横断模型的性别影响。证实雄性大鼠的术后死亡率、压疮发生率明显高于雌性大鼠。但性别因素对大鼠脊髓全横断损伤后的病理变化及功能恢复无显著影响。这些研究表明，在SCI的研究中，选择雌性大鼠进行实验的原因主要在于其并发症相对较少，便于术后护理。

2.大鼠脊髓节段定位  对于初次制作大鼠脊髓损伤模型者来说所需节段的准确定位至关重要。大鼠的T9～T11节段脊椎棘突较其他椎体棘突增生肥大明显，并且距离接近，好似融合为一体。第8胸椎对应T10节段，以此计算相应节段。此外，大鼠背部脊柱有一个明显的凸起作为对照点(神经节段T10对应的棘突)，实验中我们经常以此凸起作为标志进行定位。

3.术前准备  将各种手术器械和洞巾、棉球等高压蒸汽灭菌后放入烤箱烤干。

4.操作流程

(1)麻醉：用拇指和食指抓取大鼠的颈部，用3.6％水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射，而后将其放到新的鼠笼中，待其出现麻醉症状后再进行手术操作。

(2)术前补液：动物被麻醉后，腹腔注射5ml无菌生理盐水。

(3)固定、备皮与消毒：麻醉成功后将大鼠腹位、四肢外展，用橡皮筋将其固定于手术台上，呈俯卧位。将大鼠舌头轻轻拉向一边尽量保持呼吸通畅。

(4)手术过程：严格采用无菌技术进行手术操作。将大鼠俯卧位固定，常规备皮，消毒铺巾，以T8、T9为中心，取一背部正中切口，长1～1.5cm，逐层分离筋膜、肌肉，暴露T8～T10(第6～8胸椎)节段脊椎棘突，钝性分离T8～T10节段脊椎椎骨上的肌肉，咬骨钳咬除T8～T10节段棘突及椎板，暴露T10脊髓。用钝头的钩针完整地挑起脊髓，以特制的微型引导器或小三角针(4mm×3mm)在腹侧硬脊膜与椎管间穿10～0丝线至对侧，轻轻提起丝线，用显微剪在T8脊髓节段水平横断脊髓，丝线从断口提出，以确保脊髓已完全横断。致伤瞬间，大鼠痉挛性摆尾，双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪，为造模成功标志。用冰冻生理盐水反复冲洗以减少出血，术中严格无菌操作。术毕缝合硬脊膜，充分止血，生理盐水冲洗后逐层关闭切口，局部喷洒青霉素、链霉素预防感染，无菌敷料包扎。假手术组只打开椎板不损伤脊髓，其余步骤同脊髓损伤组。

(5)术后护理：术后将动物分笼饲养，自然光照、通风；并勤换清洁、干燥的饲养笼垫料，始终保持干燥；被尿液浸湿的肢体及时用温肥皂水清洗，并用电吹风吹干；加强营养，喂食鸡蛋、葵花籽，将饲料、饮水置于动物可及范围；严密观察动物精神状态、饮食、排尿排便、有无肢体水肿和压伤、有无泌尿系统血性分泌物等情况，给予人工排尿每日3次；腹腔注射青霉素10万U/次，每日2次；防止自残；防止肠梗阻。

(三)模型评价手段

1.BBB评分  采用Basso等提出的BBB评分体系评分，总分21分，考查大鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置。该评分简单直观，易于掌握，与脊髓恢复有极好的一致性。SCT组和假手术组动物分别在手术前1d及术后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天和第28天进行BBB评分。用以评价术后的运动功能。观察前排空膀胱，以免影响大鼠活动，而后将动物置于平坦不滑的实验台上，观察4min，对动物的躯体定位及后肢功能进行行为学评分。采用单盲法、3人独立观察记录。每次评分均在上午8：00～9：00进行(见表2-1)。

2.甩尾反射测定  将大鼠用固定器固定好，只暴露出尾部，将大鼠尾端下1/3处置于热光源聚光点处，频率为80Hz，打开开关开始记时测定，照射30s仍不出现甩尾反射，则中断照射，以免灼伤大鼠尾部皮肤。每次测量后间隔10min左右再进行下一次测量。共重复测量4次。

3.取材及形态观察  假手术组与实验组在术后相应取材日期进行取材。用体积分数3.6％水合氯醛，每100g体重注射1.5ml，腹腔麻醉后，仰卧位固定，暴露胸腔，经心脏升主动脉插管，250ml生理盐水快速冲洗5min，4％多聚甲醛经左心室至升主动脉灌注，速度先快后慢，灌注固定30min，取出脊髓组织观察大体形态，分别测量横断上下出血红肿长度、瘢痕长度及周长，然后以横断处脊髓为中心，取出长约1.5cm的脊髓组织，并以4％多聚甲醛继续固定3h，保留横断处头尾两侧各约0.5cm脊髓，常规行冠状面连续切片，片厚5μm，用于HE染色。

4.HE染色  取出保存在多聚甲醛中的脊髓，经蔗糖梯度脱水(脱水沉底顺序依次为10％→20％→30％)、石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，行HE染色，然后光镜观察脊髓损伤区及邻近部位的病理变化。

对干燥后的切片进行HE染色。具体操作如下：

(1)脱蜡：室温条件下，将切片夹于弹簧夹上，然后置于二甲苯Ⅰ(10min)→二甲苯Ⅱ(10min)→无水乙醇：二甲苯(1：1,3min)。

(2)下行梯度乙醇复水：无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95％乙醇→85％乙醇→70％乙醇→50％乙醇(各3～5min)。

(3)苏木素染色：将脱水后的切片置于苏木素内染色(15min)，然后蒸馏水洗涤2次。

(4)盐酸分化：用0.25％盐酸快速分化。

(5)蓝化：将切片置于30％左右的自来水中蓝化(20min)。

(6)上行梯度乙醇脱水：50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→95％乙醇(各3～5min)。

(7)伊红染色：将切片置于伊红染液中染色(15s)。

(8)脱水：95％乙醇(5min)→无水乙醇Ⅰ(10min)→无水乙醇Ⅱ(10min)→无水乙醇：二甲苯(1：1,3min)。

(9)透明：二甲苯Ⅰ(10min)→二甲苯Ⅱ(10min)。

(10)封片：用中性树脂胶将切片封好即可。

(四)实验操作中的注意事项    麻醉时的注意事项如下：

(1)尽量选择注射针头小的注射器，以减少创伤，一般选用5ml规格的一次性无菌注射器。

(2)注射部位一般在左下腹或右下腹，避免损伤到膀胱、胰腺、肾等重要脏器。

(3)针头刺入腹腔的长度为1/3～1/2即可。

(4)针头刺入腹腔后，一定要回抽观察是否有血液被抽出，以免药物直接进入血管。

(5)避免将液体注入大腿的肌肉中，否则药物吸收会很慢，如不慎注入可以选取另一只大鼠进行麻醉。注射错误的那只大鼠可以用作第2天的实验，不适宜同一天再次麻醉，反复麻醉会增加动物死亡率。

由于术后大鼠体温较低，应将其放在取暖器旁边以保持体温，但也要把握好距离、防止温度过高，可以将自己的手放在大鼠的位置感觉温度是否合适。

组织蔗糖梯度沉底：每次待组织沉到底部时转移到另一浓度，组织在10％和20％的蔗糖里大概需1d的时间才能沉底，在30％的蔗糖里又需1d的时间才能沉底，沉底一定要完全。否则会造成脱水不完全，从而影响组织切片的观察。

四、获得的实验结果

(一)术后动物一般情况观察

大鼠在术后2h完全清醒，两个前肢可爬行。所有损伤鼠均出现了极为典型的截瘫综合征。脊髓全横断组大鼠表现为术后1周内活动较少、饮食少，常常伴有腹部胀气、大便困难伴硬结、尿潴留、肌张力低、肌力0级、双后肢拖行。4周后个别可恢复排便、排尿或二便失禁。假手术组术后第1天功能正常。所有大鼠手术切口均愈合良好，无感染，缝线在2～3周内自动脱落；脊髓损伤组部分大鼠足部发生溃疡，有的足趾甚至脱落；大鼠后肢肌肉都有不同程度的萎缩。

(二)术后大鼠脊髓形态

假手术组硬脊膜无破损，但与周围组织有粘连。切开硬脊膜可见脊髓结构完整，手术部位脊髓光泽与其他部位一致；模型组脊髓完全离断，断端与脊膜粘连。

(三)后肢运动功能BBB评分

术前两组大鼠的BBB评分均为21分；大鼠全横断后都表现为后肢完全性瘫痪，对针刺无反应，不能自行排尿，BBB评分均为0，说明脊髓损伤模型造模成功。而假手术组在整个评分过程中评分较高，在20.57分，接近正常，损伤组和假手术组之间有显著差异(P<0.01)，损伤组BBB评分1周内无显著差异，无明显的功能恢复。损伤组术后1周后肢运动功能有所恢复，评分达到了4分，后肢全部3个关节可轻微活动；2周后，大鼠后肢运动功能进一步恢复，评分可恢复至8分，非承重情况下可以拖动或足置于不负重位，可进行自主排尿；第3～4周，与2周相比差异不大，进入平台期。

(四)甩尾反射测定

甩尾反射检测显示，脊髓全横断损伤术后28d大鼠损伤甩尾时间均较假手术组明显延长(P<0.01)，出现感觉迟钝。

(五)HE染色

假手术组除24h局部脊髓有轻度水肿外。其余各时间段脊髓外观形态均正常。手术组术后24h切口上下段脊髓组织可见水肿液化并伴坏死出血，并且脊髓上下相邻段回缩，切口间隙增大。术后7d脊髓坏死节段明显向上下段延伸，且可见陈旧出血，坏死段脊髓暗褐色、变细。原来扩大的切口间隙已有少量的瘢痕纤维连接起来。21d出血已吸收。上下断端脊髓已由白色较韧的瘢痕组织所连接。镜下观察：24h可见部分神经元坏死；7d时灰质尤其是前角神经元数量急剧减少，灰质中出现大小不等的多个空泡，灰白质空泡内壁可见大量胶质细胞增生；21d时前角可见神经元皱缩，空泡显著减少，胶质细胞增生则更明显。

五、结果分析

术前两组的评分均为21分，表明所选动物的运动功能完全正常。假手术组BBB评分分值在术后有所下降。其原因可能为手术打开椎管时虽未直接机械性刺激与损伤脊髓，但导致椎内静脉丛的损伤和出血。以及对第8胸神经及其根动脉的不同程度损伤影响了脊髓的血供，这些都可引起一定程度的脊髓休克。假手术组术后脊髓结构完整，所以BBB评分分值很快恢复到接近正常水平。

全横断组术后1d时BBB评分分值为0，也是手术成功的一个指标。脊髓损伤会引起灾难性的损害。导致感觉和自主运动功能缺失。但全横断组术后有一定的恢复。有研究显示。与上位节段完全离断的下位脊髓可以表达出复杂精细的功能，此功能产生的解剖学基础就是行走中枢模式发生器。研究表明，脊髓一旦损伤，大部分患者将引起损伤平面以下运动感觉功能障碍，Rossignol等(2001)认为，猫的中部腰髓节段的完整性对后肢运动功能起至关重要的作用。所以在不完全性或完全性脊髓损伤哺乳动物中，功能性改变被广泛地归因于损伤边缘发生了自发性重塑和(或)功能训练诱导了细胞特异性改变，而不是源于侧支出芽和神经元修复。研究表明，动物脊髓中存在着中枢性运动发生器(central pattern generator, CPG)，它能够在没有感觉冲动传入的情况下产生节奏性的后肢运动。

实验显示在脊髓横断1周后BBB评分即可达4分，后肢3个关节(髋、膝、踝)均有轻度活动，2周后后肢在非承重情况下可以拖动或足置于不负重位，这种自发性后肢功能恢复是低等动物具有的一种脊髓功能代偿形式。本文甩尾反射测定结果与HE染色结果也证明在大鼠脊髓全横断后1周内运动与感觉通路不可能重建。动物被处死后，病理检查发现脊髓全横断组脊髓完全离断，这也表明模型的制作是准确与成功的。

六、经验与体会

(1)严格控制注射麻醉剂的剂量，注射前先称量大鼠，以防注射过量导致大鼠死亡，或者注射剂量不足，大鼠提前苏醒，影响手术操作。

(2)整个过程要把握好时间，以免麻醉剂失效大鼠醒过来，影响手术操作。

(3)正式开始脊髓全横断模型的制备前，需对大鼠脊髓各个节段的特点了解清楚，并且根据该特点快速触摸并找到所需横断的节段，从而缩短手术时间。

(4)备皮分离肌肉时要尽量避开椎管上方及两旁的血管以减少出血。

(5)给大鼠进行排尿护理时，以手指触摸找到充盈的膀胱，然后按住膀胱底，自上而下挤压，使尿排出。挤压时耐心轻柔，切忌粗暴用力。如挤出困难，可用温水适当刺激膀胱区及外生殖器。防止对尿道区及外生殖器进行不适当的机械刺激，以免尿道水肿及外生殖器水肿翻出，定期清洁。

(6)进行BBB评分前，要将大鼠尿液排净，以免影响实验，评分时需认真、仔细观察大鼠的四肢的行走情况并记录。

(7)BBB评分可归结为：0～7分，主要看关节动否，有几个关节动；8～14分，看脚掌能否着地，着地后能否运动，运动是否协调；15～18分，看脚尖能否抓地，脚尖与前进方向是否一致，前后肢运动是否协调；19～21分，看运动时躯干稳不稳定，尾巴翘不翘。