摘要：真菌性角膜溃疡是世界范围内视力障碍的主要原因之一。真菌性角膜溃疡的治疗主要依靠抗真菌药物。在本研究中，我们开发了组合疗法，冷冻治疗和抗真菌剂促进真菌性角膜溃疡有效治疗。

 

 

背景：真菌尤其是丝状霉菌，在环境中无处不在，是真菌性角膜溃疡的主要原因。 真菌性角膜溃疡导致世界范围内的严重的眼科发病率和失明，特别是在发展中国家，如中国。在中国的感染性真菌性角膜溃疡的患者大多是农民，往往忽略了疾病早期阶段的眼睛疾病。真菌性角膜溃疡的特点通常是由严重的炎症，角膜溃疡，前房积脓与角膜基质中存在真菌菌丝。人角膜真菌性角膜炎分离出的多数病原菌是丝状真菌，如镰刀菌和曲霉菌属。治疗性穿透角膜移植和层状角膜移植术已显示是顽固性真菌性角膜溃疡治疗的有效方法。然而，供体角膜在像中国这样的发展中国家是很少的。此外，还有高排斥反应和移植失败率。冷冻联合抗真菌药物或角膜移植是治疗真菌性巩膜炎，角膜巩膜炎的成功方法。然而，真菌性角膜溃疡这种非穿透术角膜移植的替代方法需要进一步研究。在目前的研究中，我们开发了一个冷冻治疗和抗真菌性角膜溃疡真菌剂联合疗法。使用扫描电子显微镜（扫描电镜），透射电子显微镜（透射电镜），共聚焦显微镜和组织学染色对治疗效果进行评估。

 

方法：动物：77只新西兰白兔，体重1.5-2.5kg，用于构建真菌性角膜溃疡模型，兔健康，无眼疾病，并获得伦理委员会批准。

 

真菌悬浮液的制备：白色念珠菌、镰刀菌和烟曲霉菌 。菌种培养在沙保罗氏培养基中，28℃, 3天。孢子被收集在1毫升的生理盐水中。孢子被稀释到1×10⁷cfu/mL，浓度在10倍显微镜下通过计数获得。

 

动物模型的建立： 以往的研究建立的真菌性角膜溃疡模型均是采用基质内注射或移植的方法。在本研究中，我们开发了一个综合的方法，以提高成功率。模型建立前一周，腹腔内注射地塞米松磷酸钠（5mg/kg）三次。在建立模型前三天，每只兔子的左眼（实验用）用左氧氟沙星（4mg/ml）清洗结膜囊四次。兔通过肌肉注射0.05毫升/公斤sumaan麻醉。麻醉剂的主要成分包括二甲苯胺噻嗪和氯胺酮。左眼的角膜中央被轻轻地打上一个直径6mm的环钻和用刀片在角膜上皮钻槽。每个菌株体积为0.1毫升的真菌孢子悬浮液被注入到角膜基质。受伤的角膜用兔角膜移植片覆盖和缝合。角膜缘浅层巩膜缝合。容积0.1毫升的1×107 CFU/ml真菌孢子悬液注入到角膜基质。将氧氟沙星（0.3%）涂抹在结膜囊内，对眼睛进行睑缘缝合术，术后四零八小时，取出角膜移植片，用无菌生理盐水冲洗角膜表面。典型的真菌性角膜溃疡有以下积极的结果，被视为模型建立成功：（1）通过镜检在角膜组织中检测真菌菌丝；（2）真菌从角膜组织中分离培养；（3）用角膜组织共聚焦显微镜检测真菌孢子或菌丝。根据已发表的方法，对角膜溃疡面积、混浊程度和前房反应的病理改变进行评分。如果模型眼睛的得分低于三，眼睛被认为有一个小的病理变化。如果模型眼得分为三或更多，眼睛被认为有一个中等或大的病理变化。

 

家兔分组：成功建立了53只兔模型。家兔随机分为三组：家兔注射白色念珠菌（白色念珠菌组）、家兔注射腐皮镰刀菌（腐皮镰刀菌组），注射烟曲霉（烟曲霉组）。各组随机分为不同的治疗方法。在对照组中，我们给予氟康唑药物治疗（2mg/ml），每天一次，纳他霉素（2.5 mg/ml）每天两次。在手术组，我们给予冷冻治疗与氟康唑药物治疗（2 mg/ml）每天一次，纳他霉素（2.5 mg/ml）每天两次。

 

外科手术: 建模型后三天，家兔肌肉注射麻醉剂sumaan 0.05ml/kg。对溃疡1毫米的中心和边缘进行仔细的清除，以暴露间质的溃疡。在-50°C使用CO2干燥冷冻凝结每次历时7-8S。角膜缘和结膜囊用2mg/ml氟康唑冲洗，术后24小时缝合。缝线被拆除，并给予上述药物治疗。

 

病原真菌标本的制备及扫描电镜和透射电镜分析其微观结构：用空气栓塞法处死兔子。取下角膜并使用2.5%新戊二醇溶液固定，并在4°C保存。样品治疗前和在第十五天的治疗后进行脱水，临界点干燥，粘，涂， s-579扫描电子显微镜3500倍放大倍率下观察。透射电镜（TEM）在8000倍下，治疗前和治疗后的第十五天进行样品准备和固定，根据标准的方法。用h-7500透射电子显微镜进行观察。

 

裂隙灯与共焦显微镜检查冷冻治疗真菌性角膜溃疡的疗效：根据一个标准的过程，对不同真菌的对照组，对治疗前和治疗后第三十天的角膜样品，进行裂隙灯观察。对于不同真菌的手术组，在治疗前和术后第十五天和第三十天的角膜样品如上所述进行制备。摘取有不同真菌的对照组治疗前、治疗后第三十天的角膜样品。

 

组织学检查：菌丝的生长模式，术前和术后的第十五天的组织学变化进行了评估使用周期性过碘酸希夫（PAS）染色。术前，术后第十五天用苏木精伊红染色观察炎性细胞浸润和组织学变化。使用400倍显微镜进行染色观察。

 

结果：兔真菌性角膜溃疡模型的建立：在77只动物中，63只成功建立了真菌性角膜溃疡模型（82%）。然而，10只兔子用于预实验和剩余的53只兔子用于数据分析。不同的真菌物种在模型建立的成功率上表现出了显著的差异。白色念珠菌组成功率为91.4%，同腐皮镰刀菌组（82.4%）相似。而烟曲霉的成功率为66.7%。症状见下图：

 

冷冻对病原真菌细胞显微结构的影响：扫描电镜结果显示，联合治疗对真菌种的超微结构有很大的影响。在白色念珠菌组中，白色念珠菌的细胞扩大或大大缩小，细胞壁和细胞膜破裂。在腐皮镰刀菌和烟曲霉组，镰刀菌和曲霉菌菌丝减少或断裂。此外，细胞壁和细胞膜破裂。透射电镜的结果与扫描电镜的结果是一致的。在白色念珠菌组中，白色念珠菌细胞呈不规则球形，细胞壁和细胞膜消失。在腐皮镰刀菌和烟曲霉组，手术后细胞壁和细胞膜破裂，细胞的结构完整性被破坏了。

 

裂隙灯和激光共聚焦显微镜检查冷冻治疗真菌性角膜溃疡的疗效：裂隙灯显微镜观察显示，与药物治疗相比联合治疗对角膜溃疡有较好的治疗效果。在对照组中，不同的真菌，病变没有改善，直到治疗后的第三十天。然而，真菌性角膜溃疡不愈合直至治疗后第三十天。在不同的真菌的手术组，术后第十五天观察冷冻治疗效果与真菌性角膜溃疡愈合。共聚焦显微镜同裂隙灯观察结果相同。

 

组织学检查：观察到这两种方法的组织学结构有一个相当大的改善。观察到角膜鳞状上皮细胞的生长，溃疡的愈合和炎症细胞数量减少。

 

治疗率：手术组治疗总有效率为34.6%，对照组为74.1%。手术组的病程（13.75±4.30天）较对照组明显缩短。对于不同的病原真菌种类，有效治疗率各不相同。家兔感染白色念珠菌和腐皮镰刀菌效率优于家兔感染烟曲霉菌，但差异不显著。

 

讨论：为建立真菌性角膜溃疡动物模型，我们选择了国际上接受的角膜注射法结合角膜划痕法，以提高模型的成功率，模型的平均成功率为82%。我们的研究表明，冷冻，冷却效果与冰点的直径大小密切相关。为达到最佳效果时，凝固点为1毫米大于冷冻头，温度范围从-50°C到-60°C，冷冻时间7～8秒。溃疡切除术联合CO2冷冻治疗术的治疗效果是很有前途的。这种联合治疗的基本机制可以解释为以下几点：1）消除角膜坏死组织，可减少炎症和菌丝的数量提高冷冻治疗和抗真菌药物的吸收。（2）快速冷却可形成细胞内冰晶，破坏细胞膜.手术后再加温的过程可能会再次损伤细胞膜。此外，冷冻导致真菌细胞内蛋白质变性和降解。3）冷冻去除一部分抗原抗体复合物的，减少毒素的作用以及蛋白溶菌酶。4）在再加温过程中，刺激免疫系统。这将导致由受感染的角膜细胞产生干扰素，从而提高机体对真菌的抵抗力，促进健康组织的生长。

 

结论：冷冻治疗可显著改善真菌性角膜溃疡病理状态与少许副作用。在未来的临床应考虑这种治疗方法治疗真菌性角膜溃疡，其具有有效性和非侵入性的优势。http://link.springer.com/article/10.1186/s12886-015-0011-5