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细胞原代培养方法
2016年03月10日
来源：生物帮
作者：生物帮
责任编辑：wlladmin
摘要：细胞原代培养
2.29.1.1 胰酶消化法
(1) 器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏，置平皿中。
(2) 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
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(3) 用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
(4) 视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
(5) 加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
(6) 静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
(7) 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
(8) 加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
(9) 加入培养液l—2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。
(10) 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同(如胶原酶，透明质酶等)。
2.29.1.2 组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中(勿使组织漂起)，37℃继续培养。
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2.29.2 贴壁细胞传代方法
(1) 吸光培养瓶中的培养液。
(2) 加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置2-10min(显微镜下动态监测) 。
(3) 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
(4) 吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。
(5) 吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内。
(6) 加适量新鲜培养液于新培养瓶内。
(7) 将后者放入培养箱中培养。
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